https://doi.org/10.37815/rte.v37n1.1218

Artículos originales

Virulencia de Phytophthora sp en brotes de cacao (Theobroma cacao
L.) a nivel in vitro

Virulence of Phytophthora sp in cocoa (Theobroma
cacao L.) shoots at in vitro level

Darlyn
José Amaya-Márquez1 https://orcid.org/0000-0003-4961-0283,

Angie Lisseth Peñaherrera-Morales2  https://orcid.org/0009-0004-8631-914X, Simón Ezequiel Farah Asang1 https://orcid.org/0000-0003-3245-2936

1Faculta de
Ciencias Agrarias, Universidad Agraria del Ecuador, Guayaquil, Ecuador

[email-masked],
[email-masked]

2Universidad
Católica de Santiago de Guayaquil, Guayaquil,
Ecuador

[email-masked]

Enviado:       2024/07/15

Aceptado:       2025/04/29

Publicado:
2025/06/30

Resumen

Sumario: Introducción, Materiales y Métodos, Resultados y Discusión, Conclusiones.

Como citar: Amaya-Márquez, D., Peñaherrera-Morales, A. & Farah, S. (2025).
Virulencia de Phytophthora sp
en brotes de cacao (Theobroma cacao L.) a nivel in vitro. Revista
Tecnológica - Espol, 37(1), 310-320. https://rte.espol.edu.ec/index.php/tecnologica/article/view/1218

Phytophthora sp. es
un fitopatógeno significativo que afecta frutos, tallos, hojas, brotes de cacao
(Theobroma cacao L.) causando considerables pérdidas en la producción.
La caracterización de cepas patógenas es de gran utilidad para optimizar el
manejo de la enfermedad. Por esta razón, este estudio tuvo como objetivo
evaluar la virulencia de Phytophthora sp. en brotes de cacao bajo condiciones controladas de
cultivo in vitro. Inicialmente se llevó a cabo una caracterización
morfológica de los aislados de Phytophthora.
Posteriormente se inoculó este fitopatógeno en brotes desinfectados de dos
variedades de cacao: Nacional fino de aroma y CCN-51, siguiendo un diseño
completamente al azar factorial con siete repeticiones, utilizando los brotes
como unidades experimentales. Las variables evaluadas incluyeron incidencia,
severidad, resistencia y el área bajo la curva del progreso de la enfermedad,
las cuales fueron evaluadas diariamente durante cuatro días. La identificación
del género Phytophthora sp
fue realizado mediante la prueba molecular con primers
Internal transcribed
spacer ITS4-ITS6. Los resultados mostraron que la
incidencia y severidad en los brotes de cacao Nacional Fino de aroma alcanzaron
el 100% cuando fueron infectados con la cepa PP8, evidenciando una alta
susceptibilidad a la enfermedad conocida como como mazorca negra. En contraste,
los brotes de cacao CCN-51 no presentaron ninguna infección por las cepas
evaluadas. Se concluye que la virulencia de Phytophthora
sp. muestra dependencia específica tanto de la cepa
del patógeno como del hospedero. Estos hallazgos resaltan la importancia de
considerar la variabilidad fenotípica del patógeno y la resistencia del
hospedero para gestionar el manejo fúngico en cultivos de cacao.

Palabras
clave: Brotes, inoculación,
molecular, susceptible, resistencia.

Abstract

Phytophthora sp. is a significant
phytopathogen that affects fruits, stems, leaves, and shoots of cocoa (Theobroma
cacao L.), causing considerable yield losses. The characterization of
pathogenic strains is very useful to optimize disease management. For this
reason, the objective of this study was to evaluate the virulence of Phytophthora
sp. in cocoa shoots under controlled in vitro culture conditions. Initially, a
morphological characterization of Phytophthora isolates was carried out.
Subsequently, this phytopathogen was inoculated into disinfected shoots of two
cocoa varieties: Nacional fino de aroma and CCN-51, following a completely
randomized factorial design with seven replications, using the shoots as
experimental units. Phytophthora sp. is a significant phytopathogen that
affects fruits, stems, leaves, and shoots of cocoa, causing considerable yield
losses. The variables evaluated included incidence, severity, resistance, and
the area under the disease progress curve, which were evaluated daily for four
days. Identification of the genus Phytophthora sp was performed through
molecular testing using internal transcribed spacer primers ITS4-ITS6. The
results showed that the incidence and severity in National Fine aroma cocoa
shoots reached 100% when infected with strain PP8, evidencing a high
susceptibility to the disease known as black pod. In contrast, CCN-51 cocoa shoots
did not show any infection by the strains evaluated. It is concluded that the
virulence of Phytophthora sp. depends specifically on both the pathogen
strain and the host. These findings highlight the importance of considering the
phenotypic variability of the pathogen and host resistance to effectively
manage fungal diseases in cocoa crops.

Keywords: outbreaks, inoculation, molecular,
susceptible, resistance.

Introducción

El género Phytophthora
es uno de los patógenos fúngicos que afecta gravemente las plantaciones de
cacao (Theobroma cacao L.) a nivel mundial (Ferrer et al., 2022). En el
país, las plantaciones de cacao están expuestos a pérdidas económicas debido a
la incidencia de enfermedades que afectan la producción del mismo (Abad et al.,
2018); en este sentido, es agravante la situación debido a que se ha reportado
recientemente especies más agresivas (Phytophthora
megakarya) que P. palmivora
utilizando marcadores moleculares en la caracterización (Ali et al.,
2016; Cedeño et al., 2020).  La
variación poblacional que experimentan los patógenos en la búsqueda adaptativa
contra el hospedante, perjudica el manejo de enfermedades en el cacao.

Esta variabilidad patogénicaresalta
la influencia del patógeno y hospedero en la magnitud del daño, lo que subraya
la necesidad de obtener nuevas estrategias para el manejo eficaz de la
enfermedad, una de ellas es conocer el comportamiento de Phytophthora.

En consecuencia, es importante que los
estudios de virulencia no solo se realicen en órganos como frutos, hojas o
plantas, se debe explorar el efecto en brotes de cacao (Ali et al., 2016). A
pesar de que estudios en variedades de cacao comercial existen, es necesario
profundizar el efecto del tipo patógeno y hospedante para entender el
comportamiento del patógeno a nivel local (Ali et al., 2016).

Según Arellano (2023), evaluó la infección
de P. palmivora en tres variedades de cacao,
el cual señaló que la variedad CCN-51 es más susceptible a la afectación por
mazorca negra, y entre los menos afectados se encuentra el cacao trinitario. La
hipótesis de este estudio plantea que el nivel de afectación inducido por Phytophthora sp. puede
diferir a nivel fenotípico entre distintos materiales de cacao sometidos a
inoculación artificial. En este contexto, se ha demostrado con eficacia que los
métodos de patogenicidad permiten evaluar la tolerancia, susceptibilidad o
resistencia de los materiales de cacao (Cedeño et al., 2020). Como parte de la
investigación, se llevó a cabo una evaluación de la virulencia de la mazorca
negra provocada por Phytophthora sp. en brotes de cacao bajo condiciones controladas,
proporcionando información relevante para el manejo fitosanitario de la
enfermedad.

Materiales y Métodos

El muestreo se realizó  en plantaciones de cacao en la provincia de
Los Ríos, Ecuador, donde se detectaron síntomas de mazorca negra. A partir de
frutos afectados, se aislaron dos cepas pertenecientes al género Phytophthora sp. La
selección de muestras incluyó tanto mazorcas con necrosis como frutos sanos,
los cuales fueron posteriormente trasladados al laboratorio de biotecnología
agrícola para su análisis y procesamiento, con el objetivo de caracterizar la
patogenicidad del agente causal.

La desinfección de los frutos fue hecha
mediante una inmersión inicial en alcohol al 70%, seguida de un tratamiento con
hipoclorito de sodio al 2%. Posteriormente, los frutos fueron enjuagados con
agua destilada estéril, garantizando la eliminación de posibles contaminantes
superficiales y optimizando las condiciones para su análisis microbiológico. Se
extrajeron fragmentos de 0.5 cm de la región media tanto de frutos afectados
como sanos. Estos fragmentos fueron cultivados en placas Petri que contenían
medio PDA (Potato Dextrose Agar), enriquecido con
jugo de zanahoria al 5%, con el objetivo de favorecer el desarrollo del
patógeno y facilitar su aislamiento para su posterior análisis (Ivors, 2015).

Las placas fueron incubadas a temperatura
ambiente 22-28ºC durante 3-4 días. Cuando se observaron colonias con
características de Phytophthora sp. se realizaron subcultivos de puntas de hifas para
obtener aislados puros en nuevas placas con el mismo medio de cultivo; Las
cepas purificadas fueron conservadas para siguientes análisis. Posterior a
cinco y diez días de crecimiento, se evaluó la morfología de las colonias de Phytophthora sp., es
decir, se observó la forma de las colonias (estrella y color blanco algodonoso)
y el tiempo requerido para que el patógeno cubriera toda la superficie de las
placas Petri. La identificación del tipo de micelio, esporangios y
clamidosporas se realizó mediante tinción de azul de metileno y Lugol, y
observación bajo un microscopio óptico a 40x.

La
identificación molecular del género Phytophthora
sp. se hizo utilizando la técnica de Reacción en
cadena de la Polimerasa (PCR) con primers ITS4,
mediante el uso de primers ITS4
(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) y ITS6 (5’-GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG-3’). Para ello,
se extrajo ADN de un fragmento de micelio, raspando la superficie de la colonia
con un palillo estéril, y se realizó pre-tratamiento
de ebullición a 95.9 C. La reacción de PCR se desarrolló con el siguiente
máster mix: la mezcla de reacción para la amplificación
de ADN incluyó componentes clave en concentraciones específicas. Se empleó ADN
en un rango de 1 a 3 ng/μl, acompañado de nucleótidos trifosfatados
(dNTP) a una concentración de 200 μM.
Los cebadores ITS6 e ITS4, con una concentración inicial de 10 μM, se añadieron en una proporción final de 0.4 μM cada uno. El búfer de Taq, en
una concentración de 10x con 15 mM de MgCl₂, aseguró un entorno óptimo para la actividad
enzimática, mientras que la polimerasa Taq se
incorporó a razón de 0.05 u/μl.

Finalmente, se utilizó agua libre de
contaminantes para completar el volumen total de reacción, garantizando la
eficiencia del proceso de amplificación de regiones ITS del ADN ribosomal (Grünwald, 2011), y se amplió en un termociclador (Bio- Rad)
siguiendo el protocolo descrito a continuación: la amplificación en el
termociclador siguió una serie de pasos clave para la amplificación eficiente
del ADN. Inicialmente, se realizó la fase de desnaturalización a 94°C durante 3
minutos, seguida por ciclos de desnaturalización de 1 minuto a la misma
temperatura. Posteriormente, se llevó a cabo 35 ciclos en los que se alternaron
la fase de alineamiento a 55°C por 1 minuto y la fase de extensión a 72°C por 1
minuto.

Para concluir, se aplicó una extensión
final a 72°C durante 10 minutos, garantizando la completa amplificación del
material genético. Posteriormente, las muestras se almacenaron a -20ºC hasta su
uso, asegurando su estabilidad para análisis posteriores (Grünwald,
2011). La presencia y tamaño de los amplicones se
verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% con tinción de SYBR
Safe DNA (Invitrogen), y se compararon con un
marcador de peso molecular (Mixed DNA Ladder, Bionner).

Los brotes de cacao de las variedades
Nacional Fino de Aroma y CCN-51 fueron cortados a una longitud de 6.8 cm y
desinfectados con hipoclorito al 5% durante dos minutos, seguido de lavados en
agua destilada estéril y secado en papel toalla estéril. Se realizó una herida
en forma de equis en la parte media de los brotes usando un bisturí estéril y
en las heridas fueron colocados fragmentos de micelio de una colonia esporulada
de Phytophthora sp.
Los brotes inoculados se colocaron en cajas Petri estériles de 90 mm con dos
láminas de papel filtro humedecidas para crear una cámara húmeda y se incubaron
en oscuridad. La evaluación de la virulencia se realizó diariamente durante
cuatro días (Nyassé et al., 1995).  A partir del segundo día, posterior a la
inoculación, se estimó el porcentaje de daño midiendo la longitud de la
necrosis en los brotes. La severidad del daño se evaluó visualmente utilizando
una escala cualitativa ordinal: 0) sin síntomas, 1) puntos pequeños de
penetración, 2) fusión de las manchas marrones, 3) lesiones grandes con puntos
coloreadas marrones obscuros, menora 4 lesiones marrones grandes y extendidas (Nyassé  et al.,
1998). La resistencia del huésped se midió siguiendo la metodología de Nyassé et al., (1995); además, se estimó el área bajo la
curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) usando la fórmula de Shaner & Finney (1977).

El experimento utilizó un diseño completo
al azar de tipo factorial. El factor A constó de dos aislados del patógeno más
un testigo absoluto y el factor B correspondió a variedades de cacao, la unidad
experimental fue un brote de cacao, en total siete repeticiones corresponden a
tres tratamientos de Phytophthora sp. (dos cepas y uno sin inóculo) y el factor B a dos
variedades de cacao. Las variables calificaron los supuestos para realizar un
análisis estadístico paramétrico, por ello, se emplearon modelos lineales
generalizados mixtos y una prueba no paramétrica, utilizando el software libre Infostat versión 2020 y el software R (Di Rienzo et al., 2010).

Resultados
y Discusión

Las características
morfológicas coincidieron con las esperadas para el género Phytophthora, entre las que se menciona micelio algodonoso con apariencia blanca
que cubre la superficie de la caja Petri 90 mm en un intervalo de 15 a 18 días.
El micelio observado fue de tipo cenocítico con hifas ramificadas. Las papilas
se mostraron pronunciadas y el esporangio ovoide y periforme, estos rasgos se
atribuyen al género en estudio (Figura 1), esto coincidió con lo reportado por
Erwin & Ribeiro (1996).  Además, se identificó
clamidosporas de tipo esférica de pared gruesa (Figura 1). Las propiedades
mencionadas del patógeno coincidieron con Eden et al.
(2020) para especies de Phytophthora.

Figura 1

Características
morfológicas de aislados de Phytophthora sp

Nota:
Colonia de Phytophthora sp
in vitro. La primera fila corresponde a la cepa PP8, segunda fila cepa
PPAGR. A, B y D: crecimiento de colonia. C, E y F: Micelio y clamidospora
circular. G: Esporangio. H: esporangio y zoospora.

Caracterización
molecular

La
caracterización molecular mediante la amplificación de la región ITS (Internal transcribed spacer) usando primers
ITS6 e ITS4 permitió obtener fragmentos de ADN de aproximadamente 862 a 941
pares de bases en todas las muestras de Phytophthora,
excepto en el control negativo (Figura 2).  El tamaño de estos fragmentos fue consistente
con los reportados previamente para Phytophthora
palmivora y P. nicotinae
por Grünwald et al., (2011). También son semejantes a
los establecidos por estudios previos realizados por Bowman et al.  (2007), así como por Cooke et al. (2000), es
decir, se demostró que la amplificación mediante los cebadores ITS6 e ITS4 en
la región ITS del ADN ribosomal nuclear de Phytophthora
permite una identificación precisa del género en muestras analizadas; no
obstante, fue fundamental resaltar que la determinación a nivel de especie
puede requerir estudios filogenéticos adicionales basados en secuenciación y
comparación con bases de datos de referencia; además, se logró producir un
producto de PCR característico de P. palmivora
y P. nicotianae, con tamaños aproximados de
900 pb, resultado que fue corroborado recientemente por Latifah
et al. (2018), reforzando la validez de esta metodología en la identificación
del patógeno.

En
el primer gráfico de la Figura 3 se muestra los resultados
de la inoculación de patógeno en los brotes de cacao según la incidencia y
severidad. En este sentido, la cepa PP8 causó una mayor incidencia y necrosis
en el cacao Nacional Fino de aroma en comparación con el CCN-51. El análisis de
la severidad externa provocada por Phytophthora
en brotes de cacao durante un periodo de cuatro días reveló que la interacción
entre las cepas (A) y los materiales de cacao (B) tuvo un impacto significativo
en la magnitud del daño (p<0.001). En particular, la cepa PP8 generó una
afectación severa en los brotes de cacao a partir del segundo día de
evaluación. Asimismo, los brotes de la variedad Cacao Nacional Fino de Aroma
fueron los más perjudicados, mostrando una diferencia estadística significativa
(p<0.01) en comparación con el testigo absoluto, mientras que la variedad
CCN-51 no presentó afectación por ninguna de las cepas evaluadas.

Figura 2

Identificación
molecular de Phytophthora palmivora

Nota: Amplificación por PCR primers ITS6/ITS4 fragmentos 862-941pb en 1% de gel
de agarosa. Control negativo (-) PPAGR y PP8= Phytophthora
PP3= Fusarium. M= marcador molecular

En
el segundo gráfico de la Figura 3, se observa el área bajo la
curva del progreso de la enfermedad con base en el tamaño diario de la necrosis
provocada por Phytophthora en los brotes de
cacao. Esta ecuación establece que valores más elevados en el eje de las
ordenadas (Y) corresponden a una mayor superficie afectada en los brotes de
cacao, lo que concuerda con los resultados obtenidos en la evaluación de
severidad externa. En consecuencia, el aislado PP8 ocasionó el mayor impacto en
los brotes de Cacao Nacional Fino de Aroma, con una interacción A×B que mostró
una diferencia estadística (p<0.01) altamente significativa.

Figura 3

Evaluación de Phytophthora palmivora en brotes de cacao

Nota: a la izquierda se muestra la
severidad externa e incidencia de Phytophthora
sp. en brotes de cacao, a la derecha el área bajo la curva del progreso de la
enfermedad. Letras diferentes señalan diferencias significativas (p<0.01).

El
uso de brotes de cacao permitió estimar el grado de afectación que ejerce Phytophthora, esto fue similar a lo señalado por Latifah (2018), quien explicó que las hojas desprendidas de
cacao ofrecieron información importante en estudios de patogenicidad. Este
estudio sostuvo que el tipo de aislado influyó en los alcances de daño en
cacao, aunque CCN-51 no mostró perjuicios significativos respecto del cacao
Nacional. La no correspondencia estuvo relacionada al nivel de virulencia de
los aislados, según estudios, algunas cepas patogénicas expresaron mayor
agresividad en ciertos huéspedes de cacao (McMahon y Purwantara, 2004). Estas aseveraciones obedecieron a la
variabilidad patogénica también reportada en otros cultivos (Boccas, 1973), así como en huéspedes como coco, cacao y
pimienta negra (Slamet, 1991); de tal forma, esta
investigación sustentó que debe ser continuo el estudio de fitopatógeno en
cacao con el fin de estimar interacciones que aporten al desarrollo de nuevas
alternativas de manejo.

La
estimación del efecto de patógenos como Phytophthora
en cacao ha sido evaluado ya por un tiempo (Phillips-Mora y Galindo, 1989),
los frutos han sido incluidos como unidad experimental y asperjados con
solución de zoosporas. Nyassé et al. (1995) también
señalan un estudio mediante la inoculación artificial de P. palmivora y P. megakarya
hojas, ramas no lignificadas con el fin de mediar el nivel de tolerancia a la
enfermedad.

En
este sentido, los brotes empleados en el presente estudio fueron clave para
identificar cultivares de cacao con resistencia a Phytophthora
sp., al tiempo que permitieron evaluar la virulencia
de cepas locales del patógeno, proporcionando información relevante para el
manejo fitosanitario de la enfermedad. De acuerdo con estos antecedentes, las
plantas, y órganos del cacao pueden responder al efecto de patógenos, este
trabajo señaló que al menos uno de los aislados de Phytophthora
sp fue virulento en brotes de cacao
Nacional, mostrando alta susceptibilidad ante el patógeno; por tanto, se aceptó
la hipótesis de que existe interacción entre el tipo de aislado y hospedante.
Sin bien es cierto este estudio fue llevado a cabo bajo condiciones controladas
en laboratorio; sin embargo, dos aislados, dos materiales de cacao y una época
de evaluación no fueron suficientes para sostener estos hallazgos, por tanto,
se sugiere utilizar brotes similares en tamaño, edad, grosor e incorporar un
mayor número de cepas del patógeno y, finalmente, llevar el experimento en
condiciones de campo (Latifah, 2018), donde el
ambiente natural puede influir en estas aseveraciones (Nyassé
et al., 1995).

Conclusiones

Este estudio
determinó que el tipo de aislado de Phytophthora
sp puede influir en los daños que ejerce
el patógeno en brotes no lignificados, los brotes de cacao Nacional fueron muy
susceptible a la inoculación según la incidencia y severidad de la infección
causado por el patógeno conocido como mazorca negra. Los brotes pueden ser
usados para explorar el alcance de la enfermedad a través de la técnica de
inoculación dirigida con micelio y determinar de forma rápida la tolerancia de
genotipos de cacao.

Reconocimientos

Se agradece a la Universidad Agraria del
Ecuador por las instalaciones facilitadas para hacer posible la investigación.

Los autores declaran
que autor D.A. gestionó el financiamiento y todos los autores tuvieron una
contribución y participación equitativa de los demás roles de autoría para
esta publicación.

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